明膠酶譜法分析試劑盒操作時要進(jìn)行哪些優(yōu)化

MMPs幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的各種蛋白成分,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，從而在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視，被認(rèn)為是該過程中主要的蛋白水解酶。MMPs家族已分離鑒別出26個成員，編號分別為MMP1～26。根據(jù)作用底物以及片斷同源性，將MMPs分為6類，為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、基質(zhì)溶解素、furin活化的MMP和其他分泌型MMP。

MMP-2基因位于人類染色體16q21，由13個外顯子和12個內(nèi)含子所組成，結(jié)構(gòu)基因總長度為27kb，與其他金屬蛋白酶不同，MMP-2基因5’旁側(cè)序列促進(jìn)子區(qū)域含有2個GC盒而不是TATA盒。活化的MMP-2定位于細(xì)胞穿透基質(zhì)的突出部位，估計其在酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中有“鉆頭"的作用。

很多老師出現(xiàn)實驗做不出來，那我我們針對一些常規(guī)問題，做出以下總結(jié)，希望實驗中可以幫老師在解決一些問題。

1.分離膠一般是8-10%  濃縮膠一般是4%或者5% 如果幾次做不好 配膠可以調(diào)一下   配膠注意的是要  搖勻  加入APS和TEMED后搖晃一下    在配膠板中均勻加入  。

2.每一塊小膠電流為20 mA/gel  如果您跑2塊 增加到30mA左右  膠的數(shù)量增加 電流也需要增加  一般需要跑3-6小時 電泳要慢慢跑 慢慢壓 復(fù)性時間可以延長，特別是膠厚度大于0.75mm，保證盡量充分將SDS交換出來 

3. A液和B液孵育時間要長   Buffer B為37℃搖床孵育 

4.不要全部把substrate G反復(fù)凍融 常溫熔化和加熱 底物G 融化后取所需量加熱就可以了   10倍稀釋 比如分離膠體積是360ul,向里加入40ul的底物原液就可以 樣本濃度低 可以上樣15ul到20ul 不能超過20ul

5. 考馬斯亮藍(lán)染色后  脫色時候 要邊觀察邊脫色 15分鐘觀察一下 防止脫色太厲害，看不出來

其他操作注意事項：

1.制備聚丙烯酰胺時應(yīng)注意排除氣泡。

2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH好在7.5-7.6，復(fù)性的TRITON時間長了會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中，因為會改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6、組織或者細(xì)胞的話可以用PBS，可以用低滲溶液如三分之一或者四分之一的生理鹽水按照5倍體積加入后震蕩裂解細(xì)胞，離心即可，步驟和提蛋白很相似即可,其實重點(diǎn)的步驟主要是采用低滲裂解液進(jìn)行裂解，組織的話可以勻漿20-30次，然后10000轉(zhuǎn)左右離心，5分鐘取上清即可

另外這個實驗對內(nèi)參定量沒有特別要求需要做

①、至于WB檢測有條帶，明膠酶譜檢測沒有條帶是這樣的，這兩種檢測方法原理都不相同。一個是檢測變性條件下解離的多肽，一個是活性檢測。不是說一個有條帶另一個一定能檢測出的。

②、關(guān)于出現(xiàn)其他條帶，近我們也研究了，有2個解釋：一個就是之前說的酶家族其他成員，另一就是酶的降解產(chǎn)物。