外周血淋巴細胞分離液分離方法說明

外周血中單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞等細胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細胞不同，紅細胞和粒細胞密度較大，為1.090 g/ml 左右，而淋巴細胞和單核細胞密度為1.075～1.090 g/ml，血小板為1.030～1.035 g/ml。為此，將葡聚糖(右旋糖酐)和泛影酸葡甲胺按一定比例混合，調(diào)整比重、pH 值和滲透壓，經(jīng)過澄清及過濾除菌后制成一種密度在1.077g/ml 并且近于等滲的溶液（分層液），經(jīng)過密度梯度離心使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。

本品為帶有乳光或微乳光的注射水溶液，主要組成成份是葡聚糖（右旋糖酐）與泛影酸葡甲胺。適用于從人抗凝血液中分離單個核細胞（主要為淋巴細胞），無菌條件下所分離的細胞可用于免疫學檢測。

分離方法說明及圖例：

取新鮮抗凝血1ml，與生理鹽水1:1 混勻后，小心加于2ml細胞分離液之液面上；以400g（約1500轉(zhuǎn)/分，半徑15cm水平轉(zhuǎn)子）離心20分鐘，此時離心管中由上至下細胞分四層。第一層：為血漿層。第二層：為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層。第三層：為透明分離液層。第四層：為紅細胞層。收集第二層細胞放入含生理鹽水4-5ml的試管中，充分混勻后，以400g（約1500轉(zhuǎn)/分）離心20分鐘。沉淀經(jīng)2次洗滌后即得所需淋巴細胞。

注： 提取率約為80%。

注意事項：

A．本分離液要求血液為新鮮抗凝血，避免冷凍和冷藏；在收集血液和分離過程中，應注意無菌操作，避免微生物污染。

B．本實驗要求，在正常大氣壓下，分離液、分離樣本以及分離環(huán)境溫度為20℃±2℃。分離液在低溫時呈較高密度，在高溫時呈較低密度。細胞分離液從冰箱取出后，不可立即使用，操作前可將樣本和分離液置于20℃水浴中復溫20分鐘以保證分離溫度。

C．由于各品牌離心機的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時間，摸索佳的分離條件（具體分離條件各實驗室自定）。

D．好使用無靜電反應的離心管，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。

E．*抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。應注意在血液稀釋過程中應去除抗凝劑體積。