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PCR實驗代做:Z受歡迎的PCR論文

更新時間:2015-08-10      瀏覽次數(shù):1971

PCR是現(xiàn)代分子生物學中的一種基本技術(shù),所以它的任何創(chuàng)新或改進都受到研究人員的極大歡迎。BioTechniques的編輯們一直都非常喜歡PCR方法,我們很高興看到,2014年帶來了新技術(shù)的強大選擇。在這里,我們介紹了在過去一年中發(fā)表的5篇PCR方法相關(guān)論文,范圍很廣,從基本老式PCR反應有效性和特異性的改進,到技術(shù)如數(shù)字PCR。

1、 一種強大的耐熱dna聚合酶鏈置換活性可顯著改善DNA擴增結(jié)果

誰不喜歡一種多功能的工具呢?當你可以用有些奇怪但很方便、孩子喜歡的叉勺時,為什么還去用勺子和叉子呢?在8月刊的BioTechniques,Ignatov等人描述了DNA聚合酶的叉勺等價物,一種可用于常規(guī)PCR反應以及等溫擴增的DNA聚合酶。直到現(xiàn)在,這兩種擴增方法還需要非常不同類型的DNA聚合酶:對于PCR來說,一種耐熱DNA聚合酶(如Taq酶),可以經(jīng)受住每一個PCR循環(huán)中的熱變性步驟;對于等溫擴增來說,一種DNA聚合酶如Bst,具有很強的鏈置換活性,使DNA鏈分開而代替熱變性。Ignatov和同事們證明,一種新型Taq DNA聚合酶突變體,具有很強的鏈置換活性,稱為SD DNA聚合酶,不僅可用于PCR和環(huán)介導等溫擴增法(LAMP)以及zui近描述的聚合酶鏈置換反應方法,而且能夠改善靈敏度和效率,即使在困難的情況下,例如長片段PCR或GC富集模板的擴增。這種多用途的新型DNA聚合酶應該是對DNA擴增酶工具箱的一種受歡迎的補充。[文獻]

2、 牛凝血酶可提高聚合酶鏈式反應的效率和特異性

當PCR不能正常工作,或產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體而不是預期的擴增子時,這是非常令人沮喪的。多年來,研究人員已經(jīng)在PCR反應中添加了許多化合物,以提高DNA擴增的特異性和效率。這些添加物范圍很廣,從小的有機分子(例如甘油和甜菜堿)到非離子型洗滌劑(如Triton X-100和Tween,到蛋白質(zhì)如BSA)。不幸的是,每一種添加物只在一組特定的條件下改善PCR擴增結(jié)果。真正理想的狀態(tài)是,一種PCR增強劑在盡可能多的不同情況下都可以起作用,Xinhui Lou及其同事偶然發(fā)現(xiàn)了牛凝血酶(BT)。他們在12月份發(fā)表的論文中描述道,BT在低于BSA 20到180倍的濃度,能改善范圍廣泛的模板DNA的PCR特異性和效率,同時還能夠緩解納米材料(如氧化石墨烯和金納米粒子)引起的抑制作用。[文獻]

3、 在PCR之前線性擴增模板可改善低模板DNA的結(jié)果

一種重要的PCR擴增是,擴增少量的源DNA,為法醫(yī)或古DNA研究提供足夠的材料。然而,一個主要的問題是,提供足夠多的DNA,往往必須擴大PCR循環(huán)的次數(shù),以用于基因型分型應用,這會引起隨機抽樣效應,導致等位基因或位點脫離或雜合等位基因丟失,從而使基因型分型很難或者不可能。作為一種解決方案,KellyGriesdale和Angela van Daal假設,在PCR擴增之前,與單獨PCR擴增相比,少量目標DNA的線性擴增用于基因型分型,將會以一種更具代表性的方式,增加模板的數(shù)量。使用這種方法,他們能夠證明,與不用pre-PCR線性擴增步驟的樣品相比,從越來越少的人類基因組DNA的多重STR基因型分型重新獲得的等位基因總數(shù)顯著提高。[文獻]

4、 利用QIAshredder而不是限制性內(nèi)切酶為液滴數(shù)字PCR準備DNA的優(yōu)點

作為PCR的版本,數(shù)字PCR已經(jīng)成為定量分析高準確度靶序列的一種日益流行的方法。該技術(shù)的一個重要方面在于,在PCR之前,DNA樣本在大量分區(qū)之間的平均分布,無論是在微流控well還是在微油滴。然而,當使用大量基因組DNA時,高粘度可以影響平均分區(qū)。在這些情況下,制造商通常建議在分區(qū)步驟之前限制性消化DNA樣本。然而,這樣的反應可能是費時耗力的步驟,更不用說限制性緩沖液還會負面地影響后續(xù)的PCR。在4月份發(fā)表的一篇論文中個,Yukl等人表明,QIAshredder——含有一種生物聚合物(可降低粘度,據(jù)報道可剪切DNA)的微型離心機旋轉(zhuǎn)柱,可以代替限制性消化使用,來為液滴數(shù)字PCR(ddPCR)準備基因組DNA,從而在很寬范圍的輸入DNA數(shù)量測出更大的拷貝數(shù)。因為它節(jié)省時間和勞動力,所以當為ddPCR準備大量基因組DNA時,QIAshredder可以被看作是限制性消化的一種不錯的替代法。[文獻]

5、 在單一液滴數(shù)字PCR反應中同時定量可變剪接轉(zhuǎn)錄本

數(shù)字PCR的一個應用就是,定量來自于一個基因的可變剪接mRNA的相對數(shù)量。Yun-Ling Zheng及其同事們感興趣的是,檢測人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因產(chǎn)生的20個左右的剪接變體中的4個特定剪接變體。這四個轉(zhuǎn)錄本不同之處在于,它們是否包括α外顯子和/或β外顯子,因為它們出現(xiàn)在許多類型的腫瘤中,因此是潛在的癌癥生物標志物。他們擔心,以前測定這4種剪接變體(α–/β+; α+/ β –; α–/ β –; α+/ β+)的qPCR試驗不夠敏感,因為它們的表達水平較低,作者決定轉(zhuǎn)而使用液滴數(shù)字PCR(ddPCR)。在6月刊發(fā)表的論文中,他們設計了一種方法,在一個單一的ddPCR反應中同時測定α和β外顯子的有無,而不是用標準方法,為每個樣本設置兩次ddPCR反應,以測定每個外顯子。只使用一對PCR引物和兩種不同的雙標記熒光水解探針,Zheng的研究小組能夠在每個樣本的單次反應中比較四種剪接異構(gòu)體的水平。


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