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細胞膜蛋白提取試劑盒實驗操作!

更新時間:2021-09-06      瀏覽次數:1024
  細胞膜蛋白提取試劑盒實驗操作!
 
  產品名稱:細胞膜蛋白提取試劑盒
 
  規格:50T
 
  儲存:2~8℃保存
 
  細胞膜蛋白提取試劑盒能夠從哺乳動物新鮮或凍存的組織塊、貼壁或懸浮細胞中制備細胞膜與胞內質膜組分。其*的試劑成分與優化的制備方案使胞膜制備過程簡單易行,無需特殊設備和超速離心,可在1小時內完成。應用本試劑盒制備的胞膜是細胞膜和細胞器膜如線粒體、內質網及質膜的混合物。制備得到的產物純度可勝任后續的免疫沉淀、蛋白印跡、2-D gel、酶活性檢測和受體分析等實驗。
 
  實驗步驟:
 
  收集細胞:(在每一次制備過程中,使用等量的細胞數將明顯提高后續檢測結果的一致性,因此建議在制備前對細胞準確計數)
 
  貼壁細胞:用PBS緩沖液沖洗細胞平皿,用胰蛋白酶消化細胞。800g離心5-10分鐘,棄上清,用PBS緩沖液重懸洗滌細胞并再次離心收集細胞。
 
  懸浮細胞:800g離心5-10分鐘,棄上清。用PBS緩沖液重懸洗滌細胞并再次離心收集細胞。
 
  以下制備過程要在4 oC或冰水浴中進行
 
  組織細胞勻漿裂解
 
  向每1x107個細胞或每100µl(細胞離心后的體積)細胞沉淀中加入500µlCER試劑,震蕩重懸,冰浴2分鐘。將細胞懸液轉移到冰預冷的玻璃勻漿器內,在冰水浴中上下手動勻漿20-30次。
 
  注意:此破碎細胞步驟為關鍵環節。要使用1-3ml小容積玻璃勻漿器,須選用間隙嚴密的研杵,其特征是將研杵插入勻漿器套管后,可提起研杵而套管不會脫落。有效研磨是上下推拉而不是旋轉。破碎效果與細胞類型有關,可在相差顯微鏡下檢查,未裂解細胞應小于5%。
 
  組織塊勻漿裂解:
 
  取250mg哺乳動物新鮮或-80 oC凍存組織塊放入冰預冷的玻璃勻漿器內,加入500µlCER試劑。用研杵搗碎組織塊,上下手動勻漿20次,冰浴10分鐘,然后上下手動勻漿7次。
 
  注意:與培養細胞特別是貼壁細胞相比,組織塊中的細胞在勻漿時較易破碎,因而并非必須選擇間隙嚴密的研杵。如果研杵與套管過于嚴密,會使組織勻漿困難,可選用研杵與套管稍松的勻漿器,破碎效果與組織細胞類型有關,可在相差顯微鏡下檢查,未裂解細胞應少于5%。
 
  粗提物制備:
 
  取約500µl裂解物,轉移到新的離心管中,800g ,4oC離心5分鐘。上清為胞膜-胞漿混合物。
 
  胞膜胞漿制備:
 
  1)將步驟三獲得的上清轉移到新的離心管中,估計上清的體積;
 
  2)加入上清液1/10體積的MER與上清液混合,冰浴5分鐘;
 
  3)14,000rpm,4oC離心30分鐘;
 
  4)沉淀為胞膜組分,含有細胞膜和亞細胞器碎片,可短暫離心除盡液體,用50-100µl Suspension Buffer重懸備用或用RIPA裂解胞膜;
 
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