国产成人无码免费视频97app-一区二区在线 | 欧洲-亚洲熟妇色自偷自拍另类-中文字幕有码无码av-日韩久久无码精品不卡一区二区电影

技術(shù)文章/ ARTICLE

我的位置:首頁  >  技術(shù)文章  >  ELISA實驗中酶制劑及其底物原來那么重要

ELISA實驗中酶制劑及其底物原來那么重要

更新時間:2017-03-06      瀏覽次數(shù):1793

ELISA實驗中酶制劑及其底物原來那么重要

酶制劑及其底物

凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶,原則上均可作為標(biāo)記用。但作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求:

(1)來源方便,易于純化;

(2)比活性高,性質(zhì)穩(wěn)定;

(3)酶活性和量能

用簡單方法測定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP),其次還有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。

由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高,穩(wěn)定,分子量小,純酶容易制備,所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多個同功酶組成,分子量為40,000,等電點為PH3~9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異,但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm,一般以O(shè)D403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(zui高可達(dá)3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,純度并不表示酶活性,如當(dāng)酶變性后,RZ值仍可不變。

HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料,通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過程如下:

HRP2 ~2 y( w9 E+ M

DH2+H2O2────→D+2H2O

供氫體的種類很多,形成的產(chǎn)物特點不一。如DAB(3.3-二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物,并有電子密度,故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。S(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不夠大,且空白孔不易控制到無色,現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高,但反應(yīng)中受溫度影響較大,而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定,需要在短時間內(nèi)進(jìn)行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是:OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色,后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色,二者的可溶性均好,在避光處顏色穩(wěn)定,空白可近于無色,靈敏度上據(jù)報道后者比前者可高4倍以上。另外,還有一種供氫體稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色,且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面,ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。

由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑,因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時間反應(yīng)后呈色即達(dá)高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長時間也不會增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。

酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對于制備HRP結(jié)合物,可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。常用過碘酸鹽氧化法,這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基,醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結(jié)合。后者可進(jìn)一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。

ELISA實驗中酶制劑及其底物原來那么重要

主站蜘蛛池模板: 日韩国产一区二区三区四区五区| 国产精品亚洲精品日韩动图| 国产精品白浆在线观看免费| 熟女人妻av完整一区二区三区 | 日韩精品 第一区| 久久男人av资源网站无码软件 | 国产偷国产偷亚洲高清人乐享| 午夜无码无遮挡在线视频| 色翁荡熄又大又硬又粗又视频图片 | 无码福利一区二区三区| 亚洲国产呦萝小初| 50岁退休熟女露脸高潮| 人与禽交av在线播放| 国产精品亚洲专区无码老司国| 国产高清成人免费视频在线观看| 国产v亚洲v天堂无码网站| 久久久久久久综合综合狠狠| 毛茸茸性xxxx毛茸茸毛茸茸| 久青草国产97香蕉在线影院| 韩美视频一区二区在线观看| 奇米影视第四色首页| 欧亚精品一区三区免费| 视频一区日韩精品| 欧洲亚洲日本综合一区| 国产真实夫妇交换视频| 国产亚洲精品yxsp| 新婚人妻不戴套国产精品| 美女扒开尿口让男人桶| 99视频偷窥在线精品国自产拍 | 国产suv精品一区二区62| 91精品人妻一区二| 国产av一区二区h| 好吊妞国产欧美日韩免费观看 | 伊人伊成久久人综合网| 国产av无码一区二区二三区j| 国产高清乱码又大又圆| 欧美一区二区三区日韩| 在线无码va中文字幕无码| 国内精品国内自产视频| 日韩无套无码精品| 欧美丰满熟妇xxxx性大屁股|