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信帆生物告訴大家:如何收集用于western blot的細胞

更新時間:2016-01-12      瀏覽次數:1904

信帆生物告訴大家:如何收集用于western blot的細胞

提問:我現在在養細胞,然后收細胞抽蛋白以及提RNA用,我想先多收點細胞凍著。想問一下怎樣收集細胞,有具體的流程嗎?

我是這樣做的:

1、將細胞消化吹打后轉移至離心管離心

2、倒去上清,加1 mlPBS打勻后轉移至1.5 ml EP管

3、離心12000 rpm 2 min (不知道大家這里用多少轉速,有講究嗎?)

4、倒去上清,我是將EP管倒置一會,但是EP管里面還是有一些上清,我沒有倒干凈,請問是不是要倒干凈上清啊?因為我暫時還不抽提,離心后EP管是放到-80度冰箱保存的。這個上清對抽蛋白和RNA有影響嗎?

問題答復:

收集流程沒有什么特殊的,和你寫的一樣,主要注意以下事項:

1、1 ml的PBS可能溶不了那么多細胞(如果你細胞多的話),所以建議用3 mlPBS,分兩管裝,離完心后用Trizol溶解合成一管

2、離心的速度太大了,細胞會死的,建議800 轉,5 分鐘,一般的細胞都可以離下來

3、需要去上清,如果是提RNA就用Trizol溶解合成一管,然后放在-80度冰箱,如果提蛋白就直接將離心后的細胞放在-80度冰箱。上清對于提蛋白和RNA沒什么影響。還有一點,提RNA的東西一定要高壓,如果是初次做可以用DEPC水泡槍頭,可以提高作成功的幾率。如果操作嚴格,可以只把要用的槍頭和EP管高壓即可。

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